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沙门菌是最主要的食源性病原之一,可导致重大公共卫生问题,尤其是新出现的耐药性克隆子。大多数人类沙门菌的感染,通常与摄入了被污染的动物源性食品有关,包括猪肉、牛肉、羊肉和家禽肉等。猪肉产品是人类沙门菌感染的主要来源,国外的研究已经表明,沙门菌血清型4,[5],12:i:-引起的疫情暴发与猪肉及猪肉产品有关。另外,耐药性沙门菌是人类健康的威胁,限制了有效抗菌剂的选择,甚至可能导致沙门菌病的治疗失败。沙门菌血清型4,[5],12:i:-,与鼠伤寒沙门菌一样,是引起人类病例中最普遍的血清型之一。基于国家监控系统的一项最新调查表明,沙门菌血清型4,[5],12:i:-在河南省病人中的流行,首次超过鼠伤寒沙门菌,仅次于肠炎沙门菌,排在第二位。河南省是中国第二大猪肉生产省份,占中国猪肉产业的近10%,是否意味着在河南省猪产业链中沙门菌血清型4,[5],12:i:-的流行也超过鼠伤寒沙门菌呢,目前还没有相关报道。为了减少沙门菌的污染和确保消费者猪肉产品安全,本研究从河南省不同地区的猪场、屠宰场和零售市场上分别采集样品,沿着整个产业链监控沙门菌的流行和耐药性。同时,针对猪产业链中流行的鼠伤寒沙门菌及沙门菌血清型4,[5],12:i:-菌株,采用全基因组测序方法,通过基因组分析,探索这些菌株的毒力、耐药性和质粒的基因组学特征以及系统进化关系,试图解释沙门菌血清型4,[5],12:i:-菌株进化中获得选择性优势的可能机制。主要研究内容如下:1.河南省猪场和屠宰场中沙门菌的流行和耐药性研究为了评估河南省猪场和屠宰场健康生猪中沙门菌的流行和耐药性的多样性,2017年3月~10月,从河南省内共收集的1732份猪粪样品用于分析。沙门菌分离株,通过PCR进行鉴定。使用商业化的血清,进行分离菌株的血清学分型。采用微量肉汤稀释法测定16种药物的最低抑菌浓度。结果显示,沙门菌平均流行率为19.46%(95%CI:17.6-21.4)。与中小型猪场相比,大型猪场(存栏规模≥1000头)的流行率更高(p﹤0.0001)。从猪场采集的样品[11.77%(95%CI:10.1-13.6)]和从屠宰场采集的样品[45.23%(95%CI:40.3-50.30)]中沙门菌的流行率,存在统计学差异(p﹤0.0001)。罕见沙门菌血清型如阿格玛(Agama)和常见沙门菌血清型如德尔卑(Derby)和鼠伤寒(Typhimurium)均被分离到。高度耐药(﹥80%)的药物分别是氨苄西林(81.6%),阿莫西林/克拉维酸(80.4%),环丙沙星(100%),四环素(99.4%),强力霉素(97%)和磺胺甲恶唑(85.8%)。对四、五和七类抗菌药的多重抗药性(Multidrug resistance,MDR)在最流行血清型如德尔卑沙门菌中约为25%。总之,河南省猪场和屠宰场中沙门菌分离株对氟喹诺酮类和β-内酰胺类等关键抗生素药物存在令人担忧的高耐药性,应该引起公众关注。2.河南省猪源食品中沙门菌的流行性和耐药性研究为了调查河南省猪源性食品中沙门菌的流行和耐药性,2019年3月~2019年11月,从省内11个城市零售市场,共采集1441份猪肉和猪的内脏产品,用于沙门菌的分离培养。通过PCR法进行分离菌株的鉴定。通过玻片凝集法进行分离菌株的血清学分型。通过MIC试验进行药物敏感性检测。结果显示,我们发现219份样品(15.20%)为沙门菌分离阳性样品,包括肝脏(n=83)、胆汁(n=19)和猪肉(n=117)。通过分析发现,样品中沙门菌阳性分离菌株的最高流行率是在肝脏中,为25.86%(n=83/321),其次是在胆汁中和在猪肉中,分别为21.84%(n=19/87)和11.33%(n=117/1033)。沙门菌分离菌株被鉴定为17种不同的血清型,并将其分为5个血清组。最普遍流行的鉴定血清型是德尔卑沙门菌(32.87%),其次是里森沙门菌(25.57%)和黄金海岸沙门菌(10.50%)。研究还发现较高耐药率的药物是四环素(96.5%)、磺胺甲恶唑(96.3%),其次是氨苄西林(84.4%)和链霉素(83.7%)。对多重耐药谱(多重耐药≥3类药物)调查分析,表明印第安纳血清型(n=13)显示出最高的多重耐药性(ACSSu T-AMC-CIP,对氨苄西林、氯霉素、链霉素、磺胺甲恶唑、四环素、阿莫西林/克拉维酸和环丙沙星均耐药)流行率(100%),其次是黄金海岸血清型和德尔卑血清型。总的来说,这项研究表明,河南省猪源食品中沙门菌分离株具有相当大的多样性,高流行性、新出现的食源性多重耐药沙门菌克隆子,可能会增加临床中治疗失败的频率。3.河南省猪产业链中鼠伤寒沙门菌及沙门菌血清型4,[5],12:i:-菌株比较基因组学研究为了调查河南省猪产业链中鼠伤寒沙门菌及沙门菌血清型4,[5],12:i:-菌株的系统进化关系、耐药基因、毒力基因和质粒携带类型等信息,采用Illumina Nova Seq6000平台对91株鼠伤寒沙门菌及沙门菌血清型4,[5],12:i:-分离菌进行全基因组测序。基于细菌的全基因组数据,使用SISTR软件预测菌株的血清型,采用在线分析工具进行多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST),通过单核苷酸多态性分析,构建系统发育进化树。另外,采用相应的数据库分析软件分别对菌株的质粒类型、毒力基因和耐药基因进行分析。SISTR软件预测血清型和MLST分型结果,显示91株检测沙门菌中,有50株沙门菌的血清型和序列型(Sequence Type,ST)为血清型4,[5],12:i:-/ST34,而另外41株沙门菌的血清型和序列型为鼠伤寒/ST34(n=15)和鼠伤寒/ST19(n=26)。相比鼠伤寒沙门菌,沙门菌血清型4,[5],12:i:-在河南省猪产业链中特别是零售市场上猪肉及其内脏样品中的流行率略高,一定程度上解释了该血清型在河南病人中流行率超过了鼠伤寒血清型,排在第二位的原因。相比ST19菌株(n=26),ST34菌株(n=65)为本地区的优势序列型菌株。系统进化树分析,表明不管分离源、血清型和分离地点,所有ST19菌株或者所有ST34菌株,分别聚类在一起,构成两个分支。但是无论在ST34菌株之间,还ST19菌株之间,不同分离来源的菌株,都可能聚类在一起,表明同一种沙门菌克隆子,可能随着种猪交易,或者猪肉食物链进行远距离的传播。质粒类型分析,表明无论ST34菌株还是ST19菌株各自携带相应的偏好质粒。耐药性、耐药基因及毒力基因分析,发现91株检测沙门菌对各种药物如氨苄西林、四环素和磺胺甲恶唑等高度耐药,多重耐药率为98.90%,其中沙门菌血清型4,[5],12:i:-菌株多重耐药率为98%。相比鼠伤寒沙门菌/ST34菌株和鼠伤寒沙门菌/ST19菌株,沙门菌血清型4,[5],12:i:-菌株携带更多种类的耐药基因和毒力基因。总之,河南省猪产业链中沙门菌血清型4,[5],12:i:-菌株携带更多种类的耐药基因和毒力基因,可能是该血清型进化为优势型的主要原因之一。另外,相比鼠伤寒沙门菌/ST19菌株,鼠伤寒沙门菌/ST34菌株与沙门菌血清型4,[5],12:i:-/ST34菌株亲缘关系更密切,且具有共同携带偏好质粒,可能是沙门菌血清型4,[5],12:i:-/ST34菌株的祖先。综上所述,本研究发现无论猪场、屠宰场还是零售市场来源的沙门菌对一些关键抗菌药物如氨苄西林、环丙沙星等表现为高耐药性,但是对头孢类药物、多粘菌素等耐药低,这些研究结果为农场主或兽医临床用药提供参考依据,同时提醒政府管理部门在保持动物健康和生产安全猪肉方面,需要继续开展抗生素的管理规划,引导动物生产者明智地使用一些关键抗菌药物,避免耐药性菌株的出现构成人类公共卫生威胁。同时,本研究首次报道河南省猪产业链中沙门菌血清型4,[5],12:i:-的流行已经超过鼠伤寒沙门菌,并且揭示了该血清型的序列型、耐药性、耐药基因、携带质粒类型、毒力基因等相关信息,为该血清型在人类或者动物感染的防控研究打下基础。