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人体在感染任何一型登革病毒(Dengue virus,DENV)通常只会引起较轻型的发热并能产生特定的终生抗体,大部分只有在感染异种血清型DENV才会导致登革出血热(Dengue hemorrhagic fever,DHF)和登革休克综合症(Dengue shock syndrome,DSS)。现如今,研发出抗DENV药物是疾病防治的主要措施。病毒的生命周期主要分为病毒感染的早期阶段、进入细胞后复制阶段和子病毒的成熟和释放阶段。因此,抗DENV药物主要从病毒的吸附和进入阶段阻断病毒与细胞受体结合;病毒进入细胞后抑制病毒基因组RNA的复制、转录和蛋白质的合成;子代病毒装配完成后抑制胞吐的方式释放这几个阶段进行研究。此外,还可以通过增强机体的免疫反应来提高抵御病原体的入侵。目前尚无抗DENV的特效药被批准用于临床,需要加大使用新颖的药物化学策略及化合物数据库筛选技术,提高特异性强、毒性作用小的抗DENV药物的筛选率。研究方法:本研究通过已建立的药物体外筛选模型,对植物中分离的化合物进行抗DENV活性筛选。首先,噬斑形成实验进行初步筛选,选出其对DENV-2的半数有效浓度(50%effective concentration,EC50)值小于50μM的化合物,初步判定为具有抗DENV活性。然后结合MTT染色实验检测化合物对细胞的毒性作用,计算出细胞毒性浓度(50%cytoxic concentration,CC50)。初筛结果表明从石栗中分离出的石栗酸(CHY-5和CHY-8)具有抗DENV活性。继而,对CHY-5和CHY-8进行如下研究:(1)噬斑法:在Vero细胞感染4种DENV血清后,分别检测CHY-5和CHY-8对其抑制效果;(2)MTT染色实验:检测CHY-5和CHY-8分别对Vero和Huh7的细胞活力影响;(3)通过qRT-PCR实验检测CHY-5和CHY-8分别在Vero和Huh7细胞感染DENV后,上清中RNA的表达水平;(4)Western blot检测CHY-5和CHY-8对DENV E蛋白表达的抑制作用;(5)病毒的复制依赖宿主提供酶和底物,因此,DENV E蛋白与细胞表面的特异性受体相互识别介导进入细胞完成复制。绿茶中得到的多酚类物质表没食子儿茶素没食子酸(EGCG),可能具有直接阻断病毒颗粒与靶细胞的结合过程。将EGCG作为阻断DENV与靶细胞结合的抑制剂,qRT-PCR实验检测CHY-5或CHY-8是否能降低DENV E RNA的表达水平;(6)DENV的生命历程分为3个阶段,病毒感染前、病毒进入细胞和释放病毒颗粒。分时给药(Time of drug addition)设置不同的加药时间从而判断CHY-5或CHY-8抑制DENV复制的具体阶段;(7)DENV进入宿主后通过模式识别受体(Pattern-recognition receptors,PRRs)来识别病原体,激活先天性免疫反应,刺激感染细胞和免疫细胞释放炎症因子和趋化因子。DENV感染宿主后可激活RIG-I信号通路,诱导I型干扰素的产生;探究CHY-5和CHY-8的抗病毒作用机制。在HepG2细胞中感染DENV后,加入CHY-5/CHY-8通过RT-PCR技术检测RIG-I和MDA-5基因的表达量;(8)有研究报道二萜类化合物最主要的功效是抗肿瘤作用,除此之外,还有具有抗炎和抗病毒作用。CHY-5和CHY-8均是从大戟科植物石栗中分离出的石栗酸,属于二萜类物质。研究指出诱导I型干扰素(IFN-α/β,IL-12和IL-15)的表达并协同NK细胞发挥抗DENV作用。为了确定CHY-5和CHY-8是否具有上调IFN表达,我们进行了IFN-βRNA表达的测定。本研究在人肝癌细胞(HepG2)感染DENV,加入CHY-5或CHY-8共同培养6h后,RT-PCR检测CHY-5和CHY-8诱导I型干扰素IFN-βRNA的表达;(9)有研究指出诱导IFN的表达能促进炎症因子TNF-α的释放,增强机体的免疫反应。研究结果:建立噬斑法和四甲基偶氮唑盐(MTT)染色实验抗DENV活性初筛模型,对中国科学院昆明植物研究所刘海洋研究员送检的51个从植物中分离出的化合物进行抗DENV活性筛选,比较阳性药利巴韦林对DENV-2的EC50=40.78±1.02μM,获得两个化合物CHY-5、CHY-8具有抑制DENV的有效浓度低于利巴韦林且对细胞毒性作用小。然后,降低化合物浓度设置浓度梯度,噬斑法形成细胞的病变结果表明能有效抑制4种DENV血清型的复制。CHY-5对DENV-(1、2、3、4)的EC50分别为2.72±0.39μM、10.99±5.18μM、18.72±0.79μM、0.48±0.28μM。CHY-8对DENV-(1、2、3、4)的半数有效抑制浓度分别为12.21±5.23μM、21.71±7.89μM、>50μM、13.99±1.63μM。MTT染色实验检测结果表明CHY-5对Vero细胞的半数毒性浓度为501.11±25.59μM,Huh7细胞的CC50值>200μM。CHY-8对两种细胞的CC50均大于200μM,表明两个化合物对细胞的毒性作用很低。为进一步验证从石栗中分离的石栗酸(CHY-5和CHY-8)2个二萜类化合物对DENV的抑制作用,通过qRT-PCR检测化合物在不同细胞中对DENV E RNA的表达,结果表明两者对DENV RNA抑制强度呈剂量依赖性。病毒吸附实验比较了阻断剂EGCG和给药组DENV E RNA的表达,结果表明CHY-5、CHY-8均不影响病毒的吸附过程。分时给药实验研究设置感染时(0~2h)和感染后(2~6、6~12h和12~24h)给药,qRT-PCR检测结果显示CHY-5、CHY-8于DENV感染后0~2h和2~6h这两个阶段DENV E RNA的表达显著降低,可能通过阻断病毒的吸附或病毒进入后阶段。病原体进入宿主受体识别后激活先天性免疫反应,因此,对RIG-I样受体检测结果表明RIG-I和MDA-5基因的表达均上调。抗病毒基因的上调能有诱导I型干扰素(IFN-β)的表达,刺激炎症因子(TNF-α)的释放,增强机体抵抗病毒的能力。