目的构建天然噬菌体单域抗体展示文库,并筛选出针对抗人白细胞分化抗原20（CD20）的纳米抗体,经原核表达及纯化后,对其生物学功能包括特异性、亲和力及与细胞表面CD20分子的结合能力等进行初步研究。方法1.天然噬菌体单域抗体展示文库的构建与鉴定提取骆驼脾组织的总RNA并反转录,基于巢式PCR的方法扩增其可变区片段,构建重组载体并进行电击转化,此为初始库容,然后通过菌液PCR、序列比对等手段评估文库质量。2.抗CD20纳米抗体的生物淘筛以CD20分子为靶标,利用生物素链霉亲和素系统,从文库中进行四轮液相筛选,用phage-ELISA法对阳性克隆的重组噬菌粒初步筛选,菌体测序后获取抗CD20纳米抗体的基因序列。3.抗CD20-Fc纳米抗体的表达及鉴定将筛选到的抗CD20纳米抗体基因序列与人IgG Fc片段偶联,构建pCZN1-CD20-IgG Fc原核重组质粒,诱导表达并纯化目的蛋白（即抗CD20-Fc纳米抗体）;通过SDS-PAGE以及Western Blot等方法对其进行初步的分析与鉴定。4.抗CD20-Fc纳米抗体的生物学功能初步研究利用Western Blot和SPR方法分别验证抗CD20-Fc纳米抗体的特异性及与CD20分子的亲和力;利用量子点免疫荧光法分析抗CD20-Fc纳米抗体与表达在Daudi细胞表面的CD20分子的结合性能。结果1.天然噬菌体单域抗体展示文库的初始库容达2×107CFU/mL,抗体重组率达100%,序列比对发现均符合驼源重链抗体的特征。2.救援后的文库滴度为1×1013CFU/mL,通过四轮淘筛后,特异性吸附的噬菌粒抗体被富集,将phage-ELISA鉴定的阳性克隆进行测序,发现有2条不一致的基因序列得到富集,且均与驼源的特征性纳米抗体序列高度一致。3.成功构建重组载体pCZN1-CD20-IgG Fc,目的蛋白主要通过包涵体表达,抗CD20-Fc纳米抗体的分子量大约为40kDa,其纯度达85%以上。4.抗CD20-Fc纳米抗体能够特异性识别CD20,与CD20分子的亲和力达0.147μM;此外,能够特异性结合Daudi细胞表面的CD20分子。结论1.天然噬菌体单域抗体展示文库成功构建,且抗体重组率高,符合筛选要求,为特定纳米抗体的筛选提供了良好的筛选平台。2.成功筛选出针对CD20的纳米抗体。3.抗CD20-Fc纳米抗体具有特异性高,亲和力好,在体外能够与细胞表面的CD20分子结合等特点,可为该抗体在疾病诊疗方面的研究提供有力支撑。