论文部分内容阅读
沙门氏菌（Salmonella）为肠杆菌科、沙门氏菌属成员,可引起人与动物多种疾病,在全世界均有发生,造成严重的经济损失。外膜蛋白（Outer Membrane Proteins,OMPs）,作为细菌外膜上的主要成分之一,对细菌生命活动有着重要意义,影响细菌生存与致病性。RNA是一类可对m RNA进行调控的重要调控因子,参与细菌多种生命过程,如细菌毒力调节、适应环境的变化等,其中包括调节外膜蛋白基因的表达,同时s RNA对m RNA的调节作用往往需要伴侣蛋白Hfq参与。在许多细菌中,Hfq除了能够协同s RNA共同作用外,还能够单独调节细菌多种基因的表达,对细菌生长、毒力、侵袭力等有影响。本研究以鼠伤寒沙门氏菌LT2作为模版,进行鼠伤寒沙门氏菌omp N、fad L、ybf M、ryb B基因缺失株及omp N、fad L、ybf M颜色指示菌株及定点缺失颜色菌株的构建,并在通过分析ryb B、hfq基因缺失对鼠伤寒沙门氏菌中fad L、omp N、ybf M m RNA水平与蛋白水平变化,探究sRNA RybB与Hfq对外膜蛋白调控作用。以omp N、fad L、ybf M、ryb B、hfq基因缺失菌株进行小鼠感染性试验,研究外膜蛋白相关基因缺失对鼠伤寒沙门氏菌致病力的影响,为减毒活疫苗与新型抗菌药物研制的研究奠定基础。1.鼠伤寒沙门氏菌外膜蛋白相关基因缺失株的构建及鉴定基于λ-red同源重组与FLP/FRT系统将鼠伤寒沙门氏菌中fad L、ybf M、omp N、ryb B进行敲除,PCR测序结果说明,成功将鼠伤寒沙门氏菌中fad L、ybf M、omp N、ryb B及ryb B（GGAGCCCATC）敲除,LT2△fad L、LT2△omp N、LT2△ybf M、LT2△ryb B、LT2 ryb B△（GGAGCCCATC）构建成功。将鼠伤寒沙门氏菌缺失菌株LT2△fad L、LT2△omp N、LT2△ybf M制为相应的感受态细胞,并通过电转化将质粒p CE40分别转入相应的感受态细胞中,通过FLP/FRT系统组与LT2△fad L、LT2△omp N、LT2△ybf M去除Kn抗性片段所残留的FRT位点,构建颜色指示菌株,测序结果与氨基酸序列说明已将mud K片段插入LT2△fad L、LT2△omp N、LT2△ybf M中,并可翻译Lac Z,成功构建融合菌株LT2 fad L::Mud K、LT2 omp N::Mud K、及LT2 ybf M::Mud K。2.鼠伤寒沙门氏菌基因ryb B、hfq基因缺失对fad L、ybf M、omp N的作用为了解sRNA RybB、RNA伴侣蛋白Hfq对外膜蛋白fad L、ybf M、omp N的作用,分别将鼠伤寒沙门氏菌基因ryb B、hfq、ryb B&hfq缺失株作为供体菌,通过P22噬菌体转导,将片段△hfq::Tet Ra、△ryb B::cat、△hfq::Tet Ra△ryb B::cat转入颜色指示菌株LT2 fad L::Mud K、LT2 omp N::Mud K、LT2 ybf M::Mud K中,完成颜色指示菌株中ryb B、hfq基因的单缺失与双缺失。进行β-半乳糖苷酶活性实验和q PCR,结果表明:Hfq、Ryb B在蛋白水平分别加强、抑制fad L的表达,Hfq对fad L的调控作用大于Ryb B对fad L的调控作用;Hfq、Ryb B共同上调fad L转录水平的表达。Hfq与Ryb B可在蛋白水平与转录水平抑制omp N的表达。Hfq与Ryb B可在蛋白水平抑制ybf M的表达,两者可协同加强对ybf M的抑制作用;而在转录水平,Ryb B、Hfq分别促进、抑制ybf M的表达,Hfq对ybf M的调控作用大于Ryb B对ybf M的调控作用。总的来说,Hfq能抑制ybf M、omp N的表达、上调fad L;Ryb B对omp N、fad L具备抑制作用,但对ybf M具备上调作用。当对ybf M、fad L进行调控时,Hfq产生的调控作用大于Ryb B的调控作用。总的来说,Hfq能抑制ybf M、omp N的表达、上调fad L的表达;Ryb B对omp N、fad L具备抑制作用,但对ybf M具备上调作用。当Hfq与Ryb B对共同ybf M、fad L进行调控,Hfq产生的调控作用大于Ryb B的调控作用。为了解fad L、omp N、fad L中（ARN）n序列对fad L、omp N、fad L蛋白表达的影响,以鼠伤寒沙门氏菌LT2 RNA作为模板,通过5’RACE试剂盒确定fad L、ybf M、omp N转录起始位置,并通过RNAstructure进行fad L、ybf M、omp N 5’-UTR二级结构的预测,筛选可能的fad L、ybf M、omp N 5’-UTR（ARN）n位点。基于筛选结果,进行fad L、ybf M、omp N 5’-UTR（ARN）n定点缺失颜色指示菌株的构建。fad L中筛选出ARN-1（AAAAATAAT）、ARN-2（AAAAAA）,两个（ARN）n序列缺失降低fad L的蛋白表达量,下调倍数分别为5.4、2.3倍;△（AAAAAA）加强△hfq对fad L蛋白水平的下调作用,由2.33倍变为3.4倍、△（AAAAATAAT）减弱△hfq对fad L蛋白水平的下调作用,由2.33倍变为2.16倍。omp N中筛选ARN-1（GTTTTT）、ARN-2（TCTTTT）、ARN-3（ATTATT）、ARN-4（TTTGCT）,（ARN）n缺失可轻微改变了omp N的蛋白表达量,分别为1.29、1.3、0.9、1.07。ybf M中筛选出ARN-1（AAGAGG）、ARN-2（AGCAAT）、ARN-3（AGTAAT）、ARN-4（AAAAATAGT）、ARN-5（AACAGAAAG）,（ARN）n缺失引起ybf M蛋白水平变化,分别为4.2、3.99、10.9、227、46倍。△（AAAAATAGT）、△（AACAGAAAG）均可减弱△hfq对ybf M蛋白水平的上调作用,由134.6倍分别降低至4.12、7.25倍。ybf M、omp N、fad L中（ARN）n位点不同缺失能导致ybf M、omp N、fad L表达水平出现上调或下调,部分（ARN）n序列缺失可影响Hfq对相应靶基因蛋白水平调控作用。为探究ryb B序列对Hfq与外膜蛋白相关基因的影响,以ryb B（GGAGCCCATC）作为供体菌,通过将ryb B（GGAGCCCATC）::cat片段转入LT2△Hfq::Tet Ra中,并以颜色指示菌株LT2 ybf M::Mud K为基础,通过P22噬菌体进行株LT2 ybf M::Mud K中ryb B全缺失、ryb B△（GGAGCCCATC）、ryb B与hfq、ryb B（GGAGCCCATC）与hfq等片段的缺失。结果显示,△ryb B、ryb B△（GGAGCCCATC）均可提高Hfq对ybf M的蛋白表达的调控作用,但在改变Hfq对ybf M的蛋白表达的调控作用过程中,ryb B△(GGAGCCCATC效果不如△ryb B。ryb B中GGAGCCCATC缺失能上调ybf M、omp N、fad L的转录水平,并使△hfq对ybf M、fad L转录水平调控作用减弱,增加△hfq对omp N转录水平的调控作用;而ryb B缺失降低fad L、ybf M的转录水平、上调omp N的转录水平,并降低△hfq对ybf M、omp N、fad L转录水平调控作用。ryb B△GGAGCCCATC缺失可能影响Ryb B与Hfq结合,减弱Hfq与Ryb B间对m RNA的竞争式调控。3外膜蛋白相关基因缺失对鼠伤寒沙门氏菌致病性的影响为探究fad L、omp N、ybf M、ryb B、hfq基因缺失对鼠伤寒沙门氏菌致病性的影响,对沙门氏菌缺失菌株进行部分生物学特性与毒力测定,探究鼠伤寒沙门氏菌外膜蛋白相关基因对沙门氏菌致病性的影响。生长曲线测定结果显示,相比野生型LT2,△omp N、△ybf M、△hfq对鼠伤寒沙门氏菌的生长速率无明显影响,△ryb B降低鼠伤寒沙门氏菌的生长速率。而小鼠LD50测定结果显示,鼠伤寒沙门氏菌野生株LT2感染KM系小鼠后LD50为3.97×107CFU,LT2△omp N、LT2△fad L、LT2△ybf M LD50分别为:1.58×105CFU、6.29×105CFU、9.97×105 CFU,致病性增加,约为野生株LT2的251倍、63倍、40倍;LD50测定显示,LT2△ryb B::cat、LT2△hfq::Tet Ra、LT2△ryb B::cat△hfq::Tet Ra菌株均大于5×107 CFU。另外,肝脾细菌载量测定显示,LT2△ryb B、LT2△omp N、LT2△fad L、LT2△ybf M感染小鼠6 h、48 h后,仅有LT2△omp N、LT2△ybf M组在感染48 h后肝脏细菌载量出现升高,分别为1.27、1.1倍。LT2△hfq::Tet Ra、LT2△ryb B::cat△hfq::Tet Ra组在感染小鼠6 h、48 h后,肝脾上细菌载量主要呈现下降趋势,感染6 h后,LT2△hfq::Tet Ra、LT2△ryb B::cat△hfq::Tet Ra组肝脏细菌载量分别为0.65、0.79倍,LT2△hfq::Tet Ra组脾脏细菌载量为0.789倍;感染48 h后,LT2△hfq::Tet Ra、LT2△ryb B::cat△hfq::Tet Ra组肝脏细菌载量分别0.86、0.85倍,脾脏细菌载量分别为0.88、0.83倍。总的来说,hfq、ryb B缺失可降低鼠伤寒沙门氏菌的致病力,而fad L、omp N、ybf M的缺失提高了鼠伤寒沙门氏菌的致病力。