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流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae,Hi）是一种常见的革兰阴性菌,镜下观察呈短小杆状、球杆状、丝状等多形性,可引起脑膜炎、肺炎、中耳炎和急性会厌炎等多种疾病,其中b型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae type b,Hib）和不可分型流感嗜血杆菌（Nontypeable Haemophilus influenzae,NTHi）所致感染最为常见。随着Hib结合疫苗应用以来,Hib相关疾病的发病率得以控制,NTHi已成为儿童急性中耳炎和成人肺部疾病的主要条件致病菌之一,且由于长时间的抗生素治疗,NTHi的耐药性正逐年增加,那么通过疫苗预防NTHi显得格外重要。目前Hib结合疫苗最常用的蛋白载体为破伤风类毒素,但这种疫苗对于无荚膜的NTHi几乎不起作用。大多数研究者以外膜蛋白为候选疫苗以期达到预防和控制NTHi感染的目的,如外膜蛋白P4、P5、P6、P26、蛋白D、蛋白E、Haps蛋白等均具有潜在优势。其中外膜蛋白P6的研究较多,其保守性及免疫原性较好,在所有的Hi菌株中均存在,用P6免疫大鼠,可产生具有杀菌活性的抗P6抗体,课题组前期大量实验结果也表明:外膜蛋白P6对小鼠有一定的保护力。因此将P6蛋白与Hib荚膜多糖（PRP）结合制备荚膜多糖蛋白结合疫苗,以期可以同时预防Hib和NTHi感染,对今后开发抗Hi的新疫苗有重要意义。首先将b型流感嗜血杆菌ATCC 10211进行种子批鉴定,再通过细菌的发酵、多糖的沉淀、核酸蛋白的去除、透析等步骤,从b型流感嗜血杆菌中提取、纯化荚膜多糖得到精糖,通过1H-NMR鉴定多糖结构和高压液相分子相排阻层析测定多糖的分子量大小及分布,结果均提示为大分子聚合物;对多糖进行固体总量、核糖、核酸和蛋白质含量的测定,结果均符合药典规定。通过已知P6基因序列构建重组质粒p ET-28a（+）/P6,将含有该重组质粒的甘油菌复苏并扩大培养,IPTG进行诱导,Ni Sepharose FF亲和层析纯化,得到P6蛋白。1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸活化多糖,在特定的p H值条件下将P6蛋白与PRP结合制备PRP-P6结合疫苗。将BALB/c小鼠随机分为4组:佐剂（FA）组、FA+P6组、FA+PRP组、FA+PRP-P6组,采用滴鼻方式进行免疫,以评价PRP-P6结合疫苗的黏膜免疫效果,ELISA检测免疫小鼠血清中特异性P6、PRP IgG抗体以及小鼠鼻腔和肺部灌洗液中特异性P6、PRP IgA抗体,结果显示:FA+PRP-P6组特异性PRP IgA和IgG抗体水平都显著高于FA+PRP组和FA组,而FA+PRP组与FA组相比特异性PRP IgG抗体水平无显著性差异,鼻部和肺部IgA抗体水平增高;FA+PRP-P6组特异性P6IgA抗体水平显著高于FA+P6组,而特异性P6 IgG抗体水平与FA+P6组呈现相似的规律,但两组特异性P6、PRP IgG抗体水平均高于FA组,差异具有显著性;以上结果表明该结合疫苗可同时产生两种特异性抗体,并提示能同时引起体液免疫和黏膜免疫。ELISA方法检测脾淋巴细胞培养上清中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5和IL-17a的分泌水平,结果显示:脾淋巴细胞经P6蛋白刺激后,FA+PRP-P6组分泌的IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-17均高于FA组。与此同时,FA+PRP-P6组IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-5水平与FA+P6组相比差异无统计学意义,提示结合疫苗组与单独的P6蛋白组T细胞均参与了免疫过程中;PRP刺激各组脾淋巴细胞,FA+PRP组分泌的IFN-γ、IL-2和IL-4与FA组比较无统计学差异,提示单独的荚膜多糖免疫小鼠后不能诱导有效的T细胞免疫反应,而FA+PRP-P6组各细胞因子水平与FA组相比均显著增加,表明PRP与P6结合后成为T细胞依赖性抗原,在免疫过程中有T淋巴细胞参与。用NTHi（ATCC49247）和Hib（ATCC10211）分别对各组免疫小鼠进行鼻攻毒实验,通过HE染色观察小鼠鼻黏膜和肺组织的病理变化。经NTHi攻毒后的免疫小鼠FA+P6组和FA+PRP-P6组肺组织中炎症反应明显弱于FA组,经Hib攻毒后的免疫小鼠FA+PRP-P6组肺组织中炎症反应也明显弱于其他组,而各组鼻黏膜的病理变化均不明显。本研究制备的PRP-P6结合疫苗,经鼻黏膜免疫可引起有效的体液免疫和细胞免疫应答,并引起较强的黏膜免疫,免疫保护性实验中肺组织的病理变化显示PRP-P6对Hib和NTHi的感染有一定的预防作用。