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背景与目的：转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是一种广泛存在于多种细胞与组织内的细胞因子,在多个系统的生理、病理过程中起着重要作用,其生物学效应主要通过特异性受体TβRⅠ和TDRⅡ介导完成的。新近的研究表明,TGF-β1在多种脑损伤中具有神经保护作用。尽管TGF-β1具有治疗某些中枢神经系统(central nervous system,CNS)疾病的潜能,但由于血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的限制,外周给药方法难以将其送至CNS内。近年来,经鼻给药作为一种无创的给药途径受到了广泛关注,这一通路提供了一条绕过BBB的直接入脑途径。研究表明,许多药物可通过鼻腔进入CNS发挥作用。
本研究首先利用体外培养的皮层神经元,观察TOF-β1对神经元兴奋性损伤是否具有保护作用;随后采用经鼻方式给予成年大鼠重组人TGF-β1(recombinanthuman TGF-β1,rhTGF-β1),观测药物在各脑区及外周组织的动态分布情况,并评估TGF-β1入脑后对其自身及受体基因表达的影响;最后我们利用大鼠大脑中动脉阻塞(middle cerebral aurtery occlusion,MCAO)模型,考察TGF-β1对脑缺血损伤的治疗作用,以期为应用经鼻方式递送神经营养因子治疗CNS疾病提供理论依据。
方法：采用出生24h内的SD大鼠进行原代皮层神经元培养。在体外培养第7天,进行谷氨酸损伤及TGF-β1干预。采用台盼蓝染色评估细胞存活率,采用TUNEL染色评估细胞凋亡率。
为评价TGF-β1经鼻给药后的脑靶向性,我们将成年雄性SD大鼠随机分为经鼻给药组和正常对照组,前者经鼻给予50μl(20μg)TGF-β1,分别于经鼻给药后0.5、1、2、6 h处死大鼠。分别留取脑脊液(cerebrospinal fluid,CSF)、动脉血、鼠脑、上颈髓、双侧三叉神经、肝脏及肾脏,采用酶联免疫吸附法对样本TGF-β1的含量进行测定。
为评估经鼻给予TGF-β1后,脑组织TGF-β1及其受体基因表达是否受到影响,我们采用逆转录PCR法检测经鼻给药后3h及6h各脑区TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ基因的表达情况。
为评估经鼻给予TGF-β1对急性脑梗死大鼠的治疗作用,我们在MACO术后当天至术后第2天,每日经鼻给予大鼠50μl(20μg)TGF-β1或媒介液。分别于再灌注后2 h(经鼻给药前)及术后每天进行神经功能评分;于MCAO术后第3天采用TTC染色法评估脑梗死体积。
结果：在0.5mM谷氨酸钠作用1h后,神经元存活率显著下降,TUNEL阳性细胞比例显著升高。更换新鲜培养液继续培养24h,神经元的存活率进一步降低,凋亡率进一步提高。如果谷氨酸连续作用于神经元25h,台盼蓝排斥率仅为20.11±1.69％,TUNEL阳性细胞比例高达75.64±2.08％。在谷氨酸损伤前24h,预先向培养液中加入TGF-β1,细胞存活率显著上升,而凋亡率显著下降;10ng/mlTGF-β1预处理对神经元的保护作用优于1ng/ml TGF-β1。
经鼻给药30min后,大鼠三叉神经及多个脑区的TGF-β1浓度显著提高;60min后到达高峰;尽管药物浓度在给药后2h有所下降,但在6h后再次上升。在CNS中,嗅球的药物浓度最高,达到高峰时约为对照组的5倍,其他脑区药物浓度为对照组的2-3倍。在各实验时间点,CSF药物浓度均在检测范围下限,血浆、肝脏及肾脏TGF-β1浓度与对照组相比无统计学差异。
经鼻给予TGF-β13h和6h后,大鼠各脑区TGF-β1 mRNA表达水平与对照组相比,差异不显著;TβRⅠ、TβRⅡ基因表达水平在嗅球、嗅结节显著上调,在丘脑发生下调,而在海马、纹状体、皮层无明显变化。
自MCAO术后第2天起,经鼻给予TGF-β1组大鼠神经功能评分改善显著优于对照组。MCAO术后第3天行TTC染色结果表明,经鼻给予TGF-β1组大鼠脑梗死体积较对照组下降约51％。
结论：本研究结果表明,TGF-β1能够拮抗谷氨酸介导的神经元兴奋性损伤;采用经鼻给药方式可将TGF-β1递送入CNS,并能改善急性脑梗死大鼠神经功能缺损,降低脑梗死体积。本研究证实,经鼻给药是一条有效的、无创的CNS给药方式,采用这种新型的给药途径可使TGF-β1有效的作用于CNS并治疗脑梗死,从而为多种CNS疾病的治疗提供了新的思路。