猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis of pigs,TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）引起猪急性胃肠道疾病。仔猪主要临床症状为水样腹泻,粪便中含有血液或乳凝块并伴有恶臭味,出现严重脱水症状,一周内发生死亡,致死率高达100%;成年猪临床症状为精神沉郁、食欲下降、呕吐、水样腹泻、脱水等,该病给养猪业带来了巨大的经济损失。N蛋白是TGEV的重要的结构蛋白之一,在病毒生命周期发挥重要作用,氨基酸序列具有高度的保守性;N蛋白在TGEV基因的合成、复制、翻译过程以及致病性等方面具有重要作用,因此开发N蛋白相关临床检测技术和治疗药物具有重要的意义。纳米抗体具有分子质量小、稳定性高、高水溶性、较强的组织穿透能力、易于表达等特性。与传统的Ig G相比,纳米抗体的3个CDR区域形成的更长的凸出部分,赋予了其与抗原隐蔽表位结合的能力。因此,纳米抗体在作为研究工具、诊断工具和治疗性药物等方面具有显著优势。在本研究中,利用原核表达系统表达TGEV N蛋白免疫双峰驼,采用噬菌体文库展示技术筛选出8株针对N蛋白的特异性纳米抗体,其中一株纳米抗体（命名为Nb43）可以与血清抗体竞争性结合N蛋白。将Nb43基因构建至p EGFP-N1-RANbodies真核表达载体中,利用HEK 293T真核表达系统对该重组质粒进行表达,得到了与HRP融合表达的纳米抗体（HRP-Nb43）,以其作为竞争抗体,建立了特异性检测TGEV抗体的竞争ELISA方法。主要结果:1:TGEV N蛋白的表达和纯化将重组质粒pET-21b-N转化至Trans BL21DE3表达感受态细胞,经过IPTG诱导剂诱导后表达出可溶性的N蛋白,对其进行Ni柱亲和层析纯化。将纯化后的N蛋白与铝胶佐剂混合,用于免疫双峰驼。2:TGEV N蛋白特异性纳米抗体的筛选与鉴定对免疫5次后的双峰驼进行采血,分离其外周血淋巴细胞。将淋巴细胞中的RNA反转录为c DNA,以该c DNA为模板通过巢式PCR技术获得VHH基因序列,将该序列插入至噬菌体p CANTAB 5E载体中,通过噬菌体文库展示技术筛淘出针对TGEV N蛋白的特异性纳米抗体。通过4轮筛淘后共获得8株针对N蛋白的特异性纳米抗体,其中Nb43可以与血清抗体竞争性结合N蛋白。3:竞争ELISA检测方法的建立和评价采用棋盘滴定ELISA方法确定了抗原最佳包被量为1μg/m L,纳米抗体最佳稀释比例为1:100,血清最佳稀释比例为1:10,最佳孵育时间为40 min,最佳显色时间为10 min,并用110份阴性血清确定了该方法的Cut-off为22.4%。经测评,该方法准确性高,与间接ELISA的检测结果的符合率达到97.8%;灵敏性强,临床血清稀释度可达到1:40;重复性良好,板间PI值的变异系数在5.32%～8.81%之间,板内PI值的变异系数在2.64%～5.96%之间;特异性良好,该检测方法与其他病毒抗体呈阳性的临床血清无交叉反应;最终确定该方法具有良好的临床应用能力。综上所述,本课题筛选到了针对TGEV N蛋白的纳米抗体,以纳米抗体Nb43作为竞争抗体建立了一种TGEV抗体的竞争ELISA检测方法,该方法可以用于临床中TGEV感染情况的评估和疫苗免疫后抗体产生水平的评价。