脊髓损伤（spinal cord injury SCI）致残率高,后果严重,但损伤机制不完全清楚,白质继发损伤可能在其中起重要作用。本研究所前期研究及文献报道发现SCI后灰白质交界处存在广泛灶性出血,其中血液分解时间规律与SCI后白质细胞死亡规律高度一致,给予Fe螯合剂可减轻Fe蓄积/超载,促进神经功能恢复。最近研究显示Ferroptosis是Fe高度依赖的细胞死亡新方式。据此并结合文献我们推测SCI后可能由于局部血液分解,Fe长期蓄积,铁调节及转运蛋白异常,致少突胶质细胞Fe超载,持续产生活性氧族（Reactive oxygen species ROS）,引起细胞长时程Ferroptosis凋亡,轴突脱髓鞘甚至变性。本项目在既往研究工作基础上,拟采用离体和在体实验,结合形态学、分子细胞生物学、电生理和行为学等方法,探讨SCI后Fe超载机制及其在白质继发损伤中的作用和机制,为SCI治疗提供新靶点,为铁螯合剂的临床转化应用奠定基础。第一部分、大鼠脊髓损伤后铁超载在白质继发性损伤中的作用研究目的我们通过建立实验性大鼠脊髓损伤模型,研究铁超载在脊髓损伤后继发性白质损伤中的作用,并探讨使用DFO干预的效果。方法建立雌性大鼠脊髓T10处打击挫伤模型,用溶剂或DFO处理大鼠,实验分3组:Sham组、SCI组和DFO组。通过BBB评分和SEP检测评价大鼠后肢运动和感觉功能,通过膀胱压检测评估膀胱收缩功能,采用Perl,s染色观察组织铁超载情况,通过免疫组化染色和蛋白免疫印迹方法检测二价金属转运体1（divalent metal transporter1,DMT1）、转铁蛋白受体（transferrin receptor,Tf R）、淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein,APP）、髓鞘降解碱性蛋白（degraded myelin basic protein,d MBP）的表达情况,通过透射电子显微镜观察脊髓白质脱髓鞘程度及线粒体变化,按实验设计时间点处理各组大鼠并制备标本。结果1、脊髓损伤后大鼠后肢的BBB评分显著降低和SEP潜伏期显著延长,最大尿流率时膀胱压显著增高,SCI后大鼠出现后肢瘫痪、感觉障碍和神经源性膀胱。同时白质损伤标志物APP和d MBP蛋白水平明显升高,免疫组化染色显示少突胶质细胞计数明显减少,电镜检测提示白质轴突脱髓鞘显著增加。2、SCI后脊髓内存在广泛散在出血灶,血液分解持续释放铁,普鲁士蓝染色显示组织内铁含量明显升高,分光光度计法检测显示脊髓损伤后非血红素铁水平显著上升。3、给予去铁敏干预后,与脊髓损伤组比较,DFO能够显著降低髓内铁含量,减轻铁超载,同时白质损伤减轻,降低APP和d MBP蛋白表达,增加少突胶质细胞计数,减轻轴突脱髓鞘,同时提高SCI大鼠后肢BBB评分,缩短后肢SEP潜伏期缩,降低最大尿流率时膀胱压。4、SCI后铁转运相关蛋白Tf R和DMT1蛋白表达明显升高,且免疫荧光染色显示DMT1与少突胶质细胞标志物CC1、Tf R与CC1共标表达。在给予DFO处理后,Tf R和DMT1的表达显著下降,伴随铁超载减轻。5、大鼠SCI后可以见到脊髓内细胞Ferroptosis现象,表现为线粒体显著浓缩变小,线粒体膜密度显著增加,少突胶质细胞铁凋亡可能是SCI后铁超载导致白质损伤的机制。结论1、大鼠在本实验条件下实验性SCI后存在白质继发性损伤,同时伴有严重的神经功能障碍,脊髓损伤后组织内存在铁超载;2、DFO能够通过减轻铁超载,减轻白质损伤,改善SCI大鼠神经功能;3、少突胶质细胞内铁超载机制可能和铁转运蛋白Tf R和DMT1蛋白表达升高有关。第二部分、Ferroptosis在铁超载致少突胶质细损伤中的作用和机制研究目的建立离体少突胶质细胞铁超载损伤模型,研究铁凋亡在铁超载致少突胶质细胞损伤中的作用和机制。方法模拟SCI后髓内出血血液分解释放铁产物,将FeCl3溶液与少突胶质细胞共培养,建立少突胶质细胞铁超载模型,采用DFO进行干预。实验分组:Control组、FeCl₃组、FeCl₃+vehicle组、FeCl₃+DFO组。用Perl,s染色方法观察细胞铁超载情况,采用RT-PCR和蛋白免疫印迹方法检测转铁蛋白受体（transferrin receptor,Tf R）、二价金属转运体1（divalent metal transporter1,DMT1）基因和蛋白表达情况,采用流式细胞检测少突胶质细胞活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）的产生情况,利用细胞增值（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）检测观察少突胶质细胞的增值活性和损伤程度,采用透射电子显微镜观察少突胶质细胞铁凋亡即线粒体损伤情况,按实验设计时间点处理各组细胞并制备标本。结果1、与Control组比较,FeCl₃与少突胶质细胞共培养后采用普鲁士蓝染色显示少突胶质细胞内明显铁超载,成功建立细胞铁超载模型。2、FeCl₃组和FeCl₃+vehicle组分别与Control组比较,少突细胞铁超载后CCK-8法检测显示少突胶质细胞光密度（optical density,OD）值显著下降,即细胞增值活性减低,LDH法OD值显著增高,即细胞出现明显损伤;而在应用DFO处理后,与FeCl₃组和FeCl₃+vehicle组相比较,Perl,s染色显示细胞内铁超载显著减轻,同时伴随细胞增值活性上升,损伤减轻。3、FeCl₃组和FeCl₃+vehicle组分别与Control组比较,PCR和WB检测显示Tf R和DMT1在基因和蛋白水平表达均上升;而采用DFO干预后,与FeCl₃组和FeCl₃+vehicle组相比较,Tf R和DMT1在基因和蛋白水平表达明显减低,同时伴随着细胞内铁含量的明显下降。4、FeCl₃组和FeCl₃+vehicle组分别与Control组比较,流式检测显示细胞活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）产生量显著升高,透射电镜显示细胞典型的铁凋亡表现,即少突胶质细胞内线粒体显著浓缩变小,线粒体膜密度显著增厚;应用DFO处理后,铁超载减轻,ROS量明显下降,铁凋亡现象亦随之减轻。结论1、FeCl₃与少突胶质细胞共培养可以模拟SCI后铁超载致白质损伤;2、Tf R和DMT1可能和少突胶质细胞内铁超载密切相关;3、铁超载导致ROS产生,继而引起少突胶质细胞铁凋亡,可能是铁超载致少突胶质细胞损伤的重要机制。