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嫁接技术在农业生产和园艺研究方面起着重要的作用,同时也是探索砧穗间生物大分子长距离运输的关键手段。近年来,嫁接技术仅在不同基因型的同物种或亲缘关系近的不同种间广泛应用。由于遗传背景相似的同源嫁接并不能清晰的解析砧穗间大分子移动情况,而且跨不同物种嫁接容易形成不亲和现象最终导致嫁接失败。因此如何成功构建远缘嫁接体,是当前嫁接技术需解决的重要问题。远缘嫁接体的成功构建能够更加清晰的阐述砧穗间亲和机理及具体生物大分子的移动。本研究主要以拟南芥（Arabidopsis thaliana,At）作为接穗与本生烟草（Nicotiana benthamiana,Nb）砧木进行远缘嫁接,通过对嫁接体表型的观察、嫁接愈合处的石蜡切片技术、维管束重新连接显微观察、砧穗间管状分子（Tracheary element,TE）的扫描电镜（Scanning Electron Microscope,SEM）观察、小RNA测序、小RNA移动性分析、实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,RT-q PCR）,RT-PCR技术（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）和亚细胞定位等方法,揭示了拟南芥/本生烟草远缘嫁接体的亲和机理及砧穗间小RNA分子移动情况。主要结果如下:1.利用微嫁接技术将拟南芥与本生烟草嫁接并观察表型生长,发现嫁接体在生长过程中主要形成三种类型:微胁迫正常生长型,叶片白化型和停止生长型。前两种类型均为嫁接亲和性植株,最后一种为嫁接不亲和植株。说明远缘嫁接体可以构建成功,但同时形成亲和与不亲和两种类型的机理尚不明确。进一步对嫁接愈合处进行石蜡切片和染色处理,显微观察发现嫁接不亲和那一类木质部并没有完成重新连接而是在拟南芥接穗处横向生长并形成螺旋结构。随后将含绿色荧光蛋白拟南芥（Green Fluorescent Protein,At-35S-GFP）和在韧皮部特异表达的拟南芥（SUCROSE TRANSPORTER 2,At-Suc2-GFP）分别作为接穗与本生烟草嫁接,砧穗间纵向徒手切片观察发现亲和性植株砧木中能检测到绿色荧光信号,而不亲和植株绿色荧光信号累积在接穗螺旋结构处。初步说明砧穗间维管束未连接,横向生长形成的螺旋结构是导致嫁接不亲和的原因,而亲和性嫁接体中蛋白能够通过嫁接愈合处向下移动。2.通过5（6）-羧基荧光素二乙酸酯（5（6）-Carboxyfluorescein diacetate,CFDA）和酸性品红对嫁接体的不同时期染色,发现嫁接体在嫁接5天后完成大部分韧皮部的连接,在嫁接5天后木质部开始连接,到嫁接7天后完成大部分嫁接体木质部的重新连接。在嫁接30天后,嫁接不亲和那类CF信号和酸性品红都累积在嫁接愈合处的接触面,进一步说明维管束未重新连接导致嫁接不亲和。之后对嫁接愈合处管状分子进行剥离并通过SEM观察,首次发现砧穗愈合需要三个阶段:砧穗间管状分子首先进行分割形成小管状分子,不规则生长完成砧穗间木质部桥的搭建;然后砧穗间形成膜状细胞沉积物;最后砧穗间同质管状分子相互重叠垂直生长完成连接形成亲和性嫁接体,而非同质管状分子相互排斥横向生长形成螺旋结构导致嫁接不亲和。再次证实砧穗间螺旋结构的形成是导致嫁接不亲和的主要原因,为远缘嫁接亲和机理研究提供理论依据。3.拟南芥与本生烟草具有不用的基因组,成功构建远缘嫁接体利于砧穗间小RNA分子移动性分析。分别对拟南芥接穗和本生烟草砧木进行小RNA测序,接穗与本生烟草基因组进行比对,砧木与拟南芥基因组比对。测序得到向下移动的拟南芥Micro RNA（mi RNA）分子82个,向上移动的本生烟草mi RNA分子6个,分别是Nb-mi R395-1,Nb-mi R395-2,Nb-mi R397v,Nb-mi R156v,Nb-mi R1446v和Nbmi R164v。挑选7个向下移动的拟南芥mi RNA分子和6个向上移动的本生烟草mi RNA分子进行RT-q PCR验证,发现所有mi RNA分子表达量极低。本研究主要验证向上移动的mi RNA分子,mi R156测序可双向移动,将剩下的5个mi RNA分子在拟南芥植物中进行超表达后观察生长表型,发现Nb-mi R395-1,Nb-mi R395-2,Nb-mi R397v和Nb-mi R1446v超表达植株均无表型变化,将它们作为砧木与野生型拟南芥嫁接,嫁接体接穗也无表型变化。而Nb-mi R164v超表达植株叶片会形成缺陷,杯状或心型状,挑选表型植株作为砧木与野生型拟南芥嫁接,嫁接45天后接穗其中一片叶片发生表型改变,形成类似于杯状结构和凹陷结构。说明Nb-mi R164v能向上移动并引起接穗表型改变。随后挑选Nb-mi R395-1,Nb-mi R395-2和Nbmi R164v,通过RT-q PCR、RT-PCR和亚细胞定位检测,发现它们的成熟mi RNA分子和部分含有成熟mi RNA分子的前体序列能够向上移动。说明本生烟草mi RNA分子可通过嫁接愈合处向拟南芥接穗移动。本研究利用拟南芥/本生烟草远缘嫁接体的构建,同时发现了嫁接亲和与不亲和两种类型,石蜡切片与SEM发现嫁接不亲和是由于木质部连接失败形成螺旋结构造成。同时SEM发现在嫁接体早期形成时,砧穗间愈合过程主要有三个阶段,第一是管状分子分割成小管状分子不规则生长形成木质部桥连接砧穗;第二阶段则是嫁接愈合处膜状细胞沉积物形成;最后则是同质管状分子垂直生长完成连接形成亲和性嫁接体,非同质管状分子相互排斥横向生长形成螺旋结构导致嫁接不亲和,为远缘嫁接不亲和现象形成的原因提供了新的视野。另外结合小RNA测序技术,通过测序和验证得到了向上移动的本生烟草mi RNA分子,其中Nb-mi R164v能引起表型变化,为进一步研究向上移动的mi RNA分子的移动途径和引起表型变化的原因奠定了理论基础。