【摘 要】
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禽流感病毒（Avian Influenza Virus,AIV）是临床上常见的引起禽呼吸道疾病或者死亡的病原之一,使家禽养殖业承受巨大的经济损失,严重阻碍了养殖业的发展。AIV有多种亚型,近年来家禽中H5、H7、H9亚型AIV依然存在,同时不断有新型重组AIV出现,如H9N9、H10N3等,其中低致病性的H9N2亚型禽流感病毒在中国流行范围最为广泛,传播率最高,已经占据主导地位;H5N8取代H5N
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禽流感病毒（Avian Influenza Virus,AIV）是临床上常见的引起禽呼吸道疾病或者死亡的病原之一,使家禽养殖业承受巨大的经济损失,严重阻碍了养殖业的发展。AIV有多种亚型,近年来家禽中H5、H7、H9亚型AIV依然存在,同时不断有新型重组AIV出现,如H9N9、H10N3等,其中低致病性的H9N2亚型禽流感病毒在中国流行范围最为广泛,传播率最高,已经占据主导地位;H5N8取代H5N6成为H5亚型的优势基因型;高致病性H7N9病毒在局部地区流行,依然有扩散到其他地区的风险,这些都给AIV流行病学调查和防控带来巨大挑战。检测禽流感病毒常用的分子生物学方法包括（实时）荧光定量RT-PCR,但通常是针对一种亚型禽流感病毒进行检测,而临床上H5、H7和H9亚型AIV 比较常见,同时不断出现其他亚型AIV,如H3、H5Nx、H6和H10亚型AIV等,因此需要一种通用型和能同时检测常见亚型AIV的检测方法。TaqMan-MGB探针法荧光定量RT-PCR具有灵敏度高、特异性强、操作简单、适合大批量检测等特点。本研究建立了禽流感病毒通用型和H5/H9 TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测方法,不仅能检测多种亚型的禽流感病毒,而且能鉴定并区分H5、H9亚型和其它亚型AIV,为禽流感病毒的快速检测提供参考。1.禽流感病毒通用型和H5/H9双重荧光定量RT-PCR方法的建立本研究针对禽流感病毒的NP基因设计引物探针建立通用型荧光定量RT-PCR,针对禽流感病毒的HA基因设计引物探针建立H5、H9亚型双重荧光定量RT-PCR。AIV通用型荧光定量RT-PCR检测H1-H11亚型AIV（本实验室目前无H12-H16亚型AIV）均为阳性,具有广谱性;最低检测限度达到1X100 copies/μL,灵敏度较高;组内重复性和组间重复性的变异系数均在1%以内,重复性较好。H5/H9双重荧光定量RT-PCR检测H5、H9亚型AIV时有明显的扩增曲线,而其它AIV亚型如H1、H2、H3、H4、H6、H11亚型以及IBV、ILTV、NDV在40个循环内无扩增,特异性较强;最低检测限度达到每质粒5×100 copies/μL;组内重复性和组间重复性的变异系数均在1%以内,重复性较好。同时使用鸡胚分离法和荧光定量RT-PCR方法检测21份喉头/泄殖腔混合棉拭子样品,鸡胚分离法分别与通用型荧光定量RT-PCR及H5/H9双重荧光定量RT-PCR有90.48%的符合率,并且两种荧光定量RT-PCR方法的检测率均高于鸡胚分离法。总而言之,本研究建立的两种荧光定量RT-PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,比鸡胚分离法检测率更高,适用于样品的大批量快速检测,在检测禽流感病毒方面具有良好的应用前景。2.禽流感病毒通用型和H5/H9双重荧光定量RT-PCR方法的应用检测157份样品,AIV检出率为26.75%,H9亚型AIV检出率为21.02%,H5亚型AIV检出率为3.18%。散养鸡AIV检出率高于商品鸡;3月龄以内的鸡感染率相对较高,且AIV感染以H9亚型为主;一年四季均可发生,没有明显的季节性,在8、9、10月份,AIV阳性检出率相对较高,主要是H9亚型AIV感染;江苏、安徽省检出的AIV以H9亚型为主。综上可知,禽流感在养禽业仍然较为流行,本研究建立的荧光定量RT-PCR方法为禽流感的病原检测和防控提供支持。
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