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桑黄（Sanghuangporus.sanghuang）俗称桑臣、桑耳、桑黄菇,是一种珍稀药用真菌,隶属于担子菌门（Basidiomycota）、伞菌纲（Agaricomycetes）、锈革孔菌目（Hymenochaetales）、锈革孔菌科（Hymenochaetaceae）、桑黄属（Sanghuangporus）,通常生长在我国中南地区桑属（Morus L.）植物上。现代研究证明,桑黄菌具有明显的抗肿瘤、增强机体免疫、降血糖、抗氧化、降尿酸、抗炎等药理作用,在食用菌研究领域中,桑黄逐渐成为一个新亮点。多糖是桑黄的主要的生物活性物质,具有明显的降低血糖、抑制高尿酸、护肝纤维化、抗氧化、调节机体免疫等药理活性。桑黄多糖的研究,高产多糖的优质菌株是关键,本论文将针对本实验室前期通过ARTP诱变育种,筛选获得的高产多糖的优良桑黄菌株A130和出发菌株SH1进行液体发酵培养,对诱变前后菌丝体多糖组分进行分析比较,利用多组学技术揭示了桑黄响应ARTP辐照的生物系统反应,以及诱变前后桑黄胞内多糖合成代谢通路和关键基因的变化。通过生物信息学的手段对ARTP技术提高桑黄菌多糖产量的机制进行初步探究,从分子水平上揭示桑黄多糖的合成途径中的关键基因及其表达规律,对桑黄多糖的研究以及人工育种和栽培有非常重要的意义。本论文分为五个部分,研究结果如下:1、ARTP诱变对桑黄菌丝体多糖理化性质、结构特征及体外免疫活性的影响对出发菌株（SH1）和诱变菌株（A130）进行液体发酵,菌丝体冻干后称重,水提多糖并分级醇沉,得到6个胞内多糖组分,分别为SH1-20,A130-20,SH1-50,A130-50,SH1-70,A130-70。对它们的理化性质、结构特征及体外免疫活性进行了比较研究。结果表明:诱变菌株A130液体发酵生物量为15.80g/L,较出发菌株SH1生物量13.52g/L提升了14.43%,菌丝体多糖含量0.78g/L较出发菌株0.61g/L提升了27.86%,说明ARTP诱变可以显著提升桑黄菌丝多糖的产量。从诱变前后桑黄分级醇沉所得6个多糖组分的研究中看出,诱变后的A130菌株,液体发酵菌丝体多糖得率、多糖含量以含量都有了很大的提升,并且20%醇沉得到的多糖组分在单糖组成上差异很明显。同一洗脱时间时,A130-20对应的分子量比SH1-20要大,但粒径却比SH1-20小,这说明A130-20的结构更为紧凑。从RMS comformation图谱显示A130-20和SH1-20都是实心球状,但是A130-20结构更为紧密。经ARTP诱变的高产桑黄多糖菌株,桑黄大分子多糖A130-20的免疫活性较SH1-20有了很大提升。其原因可能是诱变后大分子葡聚糖的具有很好的免疫活性。分离纯化得到SH1-20和A130-20中的差异多糖组分A130-20-P1,结构解析表明A130-20-P1是一个大分子的β-葡聚糖,分子量为1.210×10~7Da。葡萄糖残基的连接方式分别为端基连接、1,3-连接和1,3,4-连接,摩尔比分别为1.0:2.1:1.1。可以推断A130-20-P1为大分子β-葡聚糖,平均每三个葡萄糖残基上含有一个β-1,4糖苷键连接的支链,一级结构重复单元为:2、桑黄菌（SH1）全基因组测序信息学分析采用第三代单分子测序技术,对桑黄菌SH1进行全基因组测序,最终组装得到的106个contigs数;其中,组装得到的序列中最大的contig长度5607247 bp;组装得到的序列从大到小排列,在总长50%的contig的长度为1053625 bp;所有组装contigs的总长度为34164286bp;组装得到的contig的GC含量为47.87%。利用多个数据库对桑黄全基因组基因功能注释,通过KEGG数据库共预测到339个基因参与了碳水化合物合成代谢通路,38个基因与葡聚糖合成途径有关。3、基于转录组学挖掘诱变前后桑黄多糖合成代谢途径关键基因的变化本分析完成6个样本的有参转录组测序,共获得45.12G的Clean Data,平均GC含量为48.09%。通过转录组学差异基因分析,A130 VS SH1转录组分析共得到31个差异表达基因,其中上调基因21个,下调基因10个。对31个差异基因在KEGG数据库进行富集分析,富集到两个代谢通路。一条为糖代谢通路,ko00500,挖掘到CBH1基因下调。一条为基因修复相关通路ko 03430,挖掘到MSH6基因上调。用实时荧光定量PCR对两个关键酶的基因CBH1和MSH6验证,结果显示,CBH1基因在A130 VS SH1差异倍数为0.45倍,MSH6基因的差异倍数为6.3倍,与转录组结果一致。诱变后的桑黄多糖A130-20相比于SH1-20,葡萄糖比例提升,CBH1基因下调,β-1,4-葡聚糖水解酶（EC 3.2.1.91）活性降低。诱变后多糖可以发现,A130-20中分离得到的β-葡聚糖A130-20-P1,支链中存在β-1,4糖苷键。多糖合成是一个合成、分解的动态过程,所以,CBH1基因的下调,抑制了桑黄多糖β-1,4糖苷键的水解,A130-20组分分离得到β-葡聚糖A130-20-P1,支链以β-1,4糖苷键形式存在,结果相吻合。MSH6为DNA错配修复基因,桑黄菌株受到ARTP诱变过程的等离子体的高能活性粒子作用于桑黄菌,DNA造成损伤,突变率高,有丰富的突变位点。机体DNA自身修复过程中,生物细胞引发的SOS修复机制带来多样性的错配,而这些错配修复又可能改变了控制与多糖合成相关酶蛋白的基因,从而促进了多糖的合成和桑黄菌多糖的结构的改变。4、基于蛋白质组学挖掘诱变前后桑黄多糖合成代谢途径关键酶的变化利用i TRAQ联合二维液质技术对A130和SH1进行差异蛋白质组学研究,总共鉴定到2274个蛋白,筛选可信蛋白,可信蛋白有2064个。基于筛选出的可信蛋白,以FC＞1.2且p-value＜0.05为标准筛选差异显著蛋白,A130 VS SH1蛋白组分析共得到69个差异表达基因,其中上调蛋白23个,下调蛋白46个。对69个差异蛋白在KEGG数据库进行富集分析,富集到23条代谢通路,其中一条为糖代谢通路,ko 00500,与基因组挖掘到的差异基因相吻合。该通路鉴定到三个糖代谢相关蛋白TREH,tre A,tre F。在该糖代谢通路上,α-trehalase（α-海藻糖水解酶）在A130的表达上比SH1的表达降低。促进了海藻糖的形成,在真菌孢子萌发的最初阶段,海藻糖充当能量的来源,从而促进了桑黄多糖的合成。同时海藻糖作为生物体对抗环境胁迫的重要应激保护物质,在不同生物中存在多种合成和分解代谢途径。海藻糖合成、分解及其调控是生物抗逆的重要机制。5.转录组学和蛋白质组学联合分析桑黄多糖合成代谢通路的关键酶和基因转录组和蛋白组联合分析,富集到1条和糖代谢相关代谢途径。ko00130泛醌和其他萜类醌的生物合成途径中,NADPH脱氢酶（EC 1.6.5.2）在诱变菌株A130中表达上升。NADPH脱氢酶是参与生物体中多种生理过程和生化代谢的重要氧化还原酶,可通过调节细胞氧化还原代谢中关键组分NADP（H）的含量影响体内多种反应的热力学驱动力,进而促进多糖的合成。