论文部分内容阅读
DNA损伤修复是维持基因组稳定性的重要方式。基因组稳定性与衰老和长寿有密切的关系,研究发现,长寿模式动物的DNA修复能力明显增强。DNA损伤修复功能是由DNA损伤修复酶决定的;而这些基因上的遗传多态性尤其是有功能的多态性可能参与酶的表达或活性进而影响DNA的损伤和修复。但哪些DNA损伤修复基因参与人类长寿性状的决定目前尚不清楚。本论文拟通过比较长寿人群（百岁和以上）与中年人群DNA损伤修复基因的单核苷酸多态性（SNP）,初步筛查出与人类长寿相关的DNA损伤修复基因,然后在模式生物中验证这些基因对长寿的决定作用。首先利用GO数据库查找和确定177个DNA损伤和修复相关基因,以中年人群为对照,寻找这些基因（包括基因组区域和相邻的500kb区域）上在百岁老人中显著改变的SNP位点（p<10e-04,该p值取决于Q-Q图中的p值偏离值;统计学功效大于0.7）,共筛选出5个DNA损伤和修复与长寿相关联的SNP,rs174535（FEN1;OR=1.211;p=5.943e-06）,rs1535（FEN1:OR=1.21;p=6.589e-06）,rs174576（FEN1;OR=1.209;p=7.549e-06）,rs174577（FEN1;OR=1.213;p=4.84e-06）和 rs174548（DDB1;OR=1.216;p=4.048e-06）。根据 GWAS 数据的次要等位基因分布频率和eQTL数据显示,在百岁老人中FEN1的四个SNP位点均使FEN1表达量下降,然而DDB1的SNP使DDB1表达量上升。根据基因FEN在百岁老人中表达方向,在线虫中敲低其同源基因crn-1。利用重组酶方法构建L4440敲低质粒,对L3-L4期线虫喂食crn-1基因RNAi表达菌株,实时荧光定量PCR结果显示在N2线虫中crn-1基因被敲低65%（p<0.001）,在生殖抑制型线虫sqt-3中crn-1基因被敲低82%（p<0.001）。在野生型N2线虫中实验表明,敲低基因crn-1的线虫相比于对照组,中期寿命和最大寿命均延长16%（p<0.001）,表明crn-1参与了寿命的调节并且抑制其表达可以显著延长线虫寿命。此外,在DNA损伤试剂过氧化氢处理下,敲低基因crn-1的线虫相比于对照组存活率偏低（p<0.05）,抵抗氧化型损伤的能力明显减弱,说明crn-1基因的敲低导致线虫的寿命延长并不是通过提高了 DNA修复能力。我们进一步研究发现,敲低crn-1的线虫的子代孵育率降低60%左右（p<0.01）,暗示crn-1基因在个体发育阶段发挥重要作用。对L3-L4期线虫喂食ddb-1基因RNAi表达菌株,实时荧光定量PCR结果显示在N2线虫中ddb-1基因被敲低80%（p<0.001）,在生殖抑制型线虫sqt-3中ddb-1基因被敲低77%（p<0.001）。在野生型N2线虫中实验表明,敲低基因ddb-1的线虫相比于对照组寿命无显著差异。在紫外线诱导的DNA损伤模型中,敲低基因ddb-1的线虫相比于对照组寿命显著缩短20%（p<0.001）,表明ddb-1基因参与DNA损伤与修复过程。综上所述,本课题通过百岁老人GWAS数据分析,发现DNA损伤修复相关的导致长寿性状的SNP及相应基因FEN1和DDB1。首次发现在线虫敲低FEN1的同源基因crn-1可以延长线虫的中期和最大寿命,crn-1通过调节损伤修复影响寿命的机制可能较为复杂。此外,敲低crn-1基因会导致子代孵育率下降。同时证明在紫外照射下敲低ddb-1基因,显著缩短线虫寿命。本研究为长寿基因的筛选及长寿性状发生的可能机制提供新的研究思路。