黑豆抗氧化肽抑制油脂氧化作用解析

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油脂氧化导致食用油脂品质的劣变、必需脂肪酸的损失以及有害物质的形成,严重影响油脂食品的营养性和安全性。添加脂溶性抗氧化剂是控制油脂和含油食品氧化最直接有效的方式,目前工业上最常使用的特丁基对苯二酚(TBHQ)、2,6-二叔丁基对甲基苯酚(BHT)等化学合成抗氧化剂有一定的安全风险,而亲脂天然多酚类抗氧化剂除了种类有限,还会进一步引起促氧化反应。抗氧化肽可以有效消除体内自由基堆积、控制体内脂质氧化,但其发挥抗脂质氧化作用的具体机制目前尚不清楚。因此,本研究以黑豆源脂溶性抗氧化肽为研究对象,建立指纹图谱,探究结构与抗氧化功能间的关系,通过食用油脂体系和模拟油脂体系的变化规律,阐明黑豆抗氧化肽抑制油脂氧化的作用机理,以期为合成抗氧化剂的替代提供应用基础,为其应用于复杂油脂系统提供科学依据与理论参考。主要结果如下:首先,制备黑豆蛋白水解产物,采用超声波辅助溶剂法提取脂溶性多肽,评价其抗氧化活性及结构特征。响应面试验分析表明,采用菠萝蛋白酶水解的最佳条件为:水解时间4.2 h,酶浓度1.8%,水解p H 7.0,温度55°C,在此条件下制备的脂溶性多肽的初级、次级氧化产物抑制率(IC50值)分别为7.75 g/L和5.12 g/L。所提取的脂溶性多肽结构变化明显,主要表现为:脂溶性蛋白的临界胶束浓度(CMC)更小,紫外吸收光谱在280 nm附近出现强吸收峰,荧光吸收峰的增高,均说明提取后多肽具备更强的疏水性;脂溶性多肽相较于水解产物的圆二光谱,出现可能有利于抗氧化能力的高β-型的新构象。其次,利用HPLC构建特征指纹图谱,鉴定脂溶性黑豆抗氧化肽的活性。特征指纹图谱共分析出30个共有峰。对11组水解物进行相似性分析,各组间相似度在0.961~0.999之间。采用灰色关联度分析法,收集7个主要特征峰组分,并对其抗氧化活性进行测定。其中特征峰1和8号的抗氧化活性最强,初级、次级氧化产物抑制率分别为55.34±0.57%、41.15±3.34%和30.22±7.38%、29.82±2.00%;经液相色谱-质谱(LC-MS/MS)分析,从1号和8号特征峰中分别鉴定出57条和44条肽段,分子量范围为258.65 Da~1443.70 Da;筛选出MFVPHY、ILF、LPSVL、RIRLL、YPFVVN、PAGTTYYVV、PFLLG、FPPPKVI、FPPPHVI、FPAI等10条肽段,其初级氧化产物抑制率为7.17%~32.09%,次级氧化产物抑制率为11.24%~41.15%,均呈现一定的抗氧化活性。然后,选用葵花籽油作为食用油脂的代表,探究了抗氧化肽对葵花籽油氧化稳定性的影响。结果表明:ILF与LPSVL均能有效降低葵花籽油的酸价和过氧化值;ESR实验中,抗氧化肽ILF和LPSVL均可使葵花籽油中烷基自由基、烷过氧自由基的信号强度降低,在抑制葵花籽油自由基的产生方面具有较好的作用;对挥发性产物的影响方面,ILF对三种主要醛类物质(己醛、(Z)-2-庚烯醛和(E)-2-辛烯醛)的抑制效果较为突出,而LPSVL抑制(E,E)-2,4-癸二烯醛的生成时,效果更为明显;透射电子显微镜观察发现添加了黑豆抗氧化肽的大部分油滴仍然可以保持圆形结构,相较于新鲜葵花籽油,氧化过程明显延迟;通过拉曼光谱发现,ILF和LPSVL在加热氧化过程中,自身的分子构象未发生改变。最后,构建以亚油酸甲酯为代表的模拟油脂体系,解析黑豆抗氧化肽的抗油脂氧化行为,进而阐释ILF和LPSVL的抗氧化机制。借助核磁共振氢谱,定性定量分析氧化体系中的氧化产物,发现ILF和LPSVL能有效抑制n-烷醛、伯醇等氧化产物生成;采用ESR检测亚油酸甲酯氧化过程中自旋总数的变化,加入ILF和LPSVL的样品对自由基产生的抑制作用大于对照组,其中ILF抗氧化效果更好;液质检测发现ILF与LPSVL在加热氧化过程中的含量呈现不断下降的趋势;通过加热0 h和15 h的质谱图对比发现,加热过程中,ILF中的异亮氨酸最先降解,LPSVL中的亮氨酸和脯氨酸则先后降解。
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