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目的:拟用本实验前期制备的Ang2-si RNA质粒壳聚糖磁性纳米微粒,经尾静脉注射入小鼠及大鼠体内,观察该微粒的安全性及毒理性,建立恶性黑色素瘤裸鼠模型,观察Ang2-si RNA质粒壳聚糖磁性纳米微粒的靶向性,为后期进一步进行裸鼠恶性黑色素移植瘤的血管生成和肿瘤生长的体内靶向性干预实验奠定基础,为恶性黑色素瘤的基因靶向治疗提供新途径和实验依据。方法:1、Ang2-si RNA质粒载体壳聚糖磁性纳米微粒急性毒性实验急性毒性实验的考察选择KM小鼠作为实验对象,分别经尾静脉一次性给予小鼠五种浓度(91.6mg/kg、152.8mg/kg、254.6mg/kg、424.2mg/kg、707.0mg/kg)的Ang2-si RNA质粒载体壳聚糖磁性纳米微粒,对照组注射等体积生理盐水,连续观察14天内小鼠的死亡、饮食及体重变化,大体标本观察脏器颜色、形态,并且对心、肝、脾、肺、肾等主要脏器进行病理组织检查,HE染色和普鲁士染色观察脏器的情况。2、Ang2-si RNA质粒载体壳聚糖磁性纳米微粒重复给药实验研究慢性毒性实验将SD大鼠作为实验对象,将其分为四组,即低、中、高浓度剂量组(35.35mg/kg、70.70mg/kg、353.50mg/kg)及对照组,对照组予以注射生理盐水,均予以尾静脉注射微粒悬浮液1ml,连续注射14d,第15d停药,继续观察7d,观察给药后大鼠的一般表现及体重变化情况,第21d处死小鼠,取眼球血进行血常规及生化检查,大体标本观察脏器颜色、形态,对主要脏器进行病理学检查,HE染色和普鲁士染色观察脏器的情况。3、Ang2-si RNA质粒载体壳聚糖磁性纳米微粒体内靶向性研究构建恶性黑色素瘤裸鼠移植瘤模型,将处于对数生长期的恶性黑色素瘤细胞制成细胞悬液,将其接种于裸鼠右腋皮下,待裸鼠皮下肿瘤长至约6mm×6mm时,将荷瘤鼠随机分成3组,分别为靶向组,非靶向组以及空白对照组。靶向组荷瘤裸鼠通过尾静脉注射壳聚糖磁性纳米微粒溶液0.4ml,紧贴右腋皮下外加4000GS的磁场,60min后撤去磁场,同时立即处死裸鼠;非靶向组荷瘤裸鼠通过尾静脉注射质粒耦连微粒0.4ml,体外不加磁场,60min后立即处死裸鼠;空白对照组的荷瘤裸鼠通过尾静脉注射等体积的生理盐水,体外不加磁场,60min后立即处死裸鼠。处死后进行肿瘤组织病理学检查,HE染色及普鲁士蓝染色验证微粒在肿瘤组织中的分布。结果1、Ang2-si RNA质粒载体壳聚糖磁性纳米微粒急性毒性实验空白组及各浓度组小鼠给药后均未出现死亡,Ang2-si RNA质粒载体壳聚糖磁性纳米微粒的LD50>707.0mg/kg,远高于临床所需量,对小鼠的饮食、体重无明显影响,且主要脏器除了高浓度组引起部分肺淤血外,余未见明显异常,表明其急性毒性相对较低。2、Ang2-si RNA质粒载体壳聚糖磁性纳米微粒重复给药实验研究Ang2-si RNA质粒载体壳聚糖磁性纳米微粒对大鼠的一般活动表现、饮水、摄食、体重增长以及肝肾功能无明显影响,经大鼠主要脏器病理学组织检查,中、高剂量组引起大鼠肺部慢性非肺淤血及纤维化,低剂量组大鼠主要脏器组织病理学未见明显异常,可以认为本实验的最低剂量35.35mg/(kg.d)×14d,对受试动物基本无毒性,所以在一定的浓度范围内,该药物长期使用是安全的。3、Ang2-si RNA质粒载体壳聚糖磁性纳米微粒体内靶向性研究空白对照组肿瘤组织普鲁士蓝染色阴性,非靶向组肿瘤组织普鲁士蓝染色呈弱阳性,靶向组肿瘤组织被膜及血管内大量的颗粒聚集,普鲁士蓝染色强阳性。由此可以推断,Ang2-si RNA质粒载体壳聚糖磁性纳米微粒在外加磁场的作用下,能定向向肿瘤组织移动,并且聚集在恶性黑色素移植瘤内,从而达到抑制肿瘤生长的目的。结论Ang2-si RNA质粒载体壳聚糖磁性纳米微粒毒作用的靶器官主要是肺部,主要是引起肺部炎症,急慢性肺淤血,肺部纤维化,但是该微粒对小鼠、大鼠的一般表现、摄食、饮水、体重及肝肾功能无明显影响。其LD50>707.0mg/kg,长期毒性无毒反应剂量>35.35mg/(kg.d)×14d,根据等效剂量系数折算法,人的无毒反应剂量剂量>222.71mg/(kg.d)×14d,即3117.87mg/kg,远高于临床所需量,可以认为在一定剂量范围内,该颗粒是安全的。Ang2-si RNA质粒载体壳聚糖磁性纳米微粒体内靶向性研究证明了在外加磁场的作用下,该微粒能够定向向靶组织移动,具有靶向给药系统载体的特性,可以作为一种可靠有效的靶向给药载体,在肿瘤靶向治疗中具有较好的应用情景,而且为后期进行裸鼠恶性黑色素移植瘤的血管生成和肿瘤生长的体内靶向性干预实验奠定基础。