【摘 要】
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根据GenBank已登录的猪链球菌9型(SS9)cps9H基因保守部分序列设计合成引物和TaqMan荧光探针,以定量的10倍系列稀释含cps9H部分基因的T载体重组质粒(pGEX-T-cps9H)为标准品,进行荧光定量PCR扩增并制作了标准曲线,经对荧光定量PCR的反应条件进行优化,建立了SS9型的TaqMan 荧光定量PCR检测方法(Taqman FQ-PCR);对所建立的FQ-PCR检测方法进
【机 构】
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河南省动物疫病预防控制中心 河南 郑州 450008 周口市动物疫病预防控制中心,河南 周口 46
【出 处】
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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第三届猪病防控学术研讨会
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根据GenBank已登录的猪链球菌9型(SS9)cps9H基因保守部分序列设计合成引物和TaqMan荧光探针,以定量的10倍系列稀释含cps9H部分基因的T载体重组质粒(pGEX-T-cps9H)为标准品,进行荧光定量PCR扩增并制作了标准曲线,经对荧光定量PCR的反应条件进行优化,建立了SS9型的TaqMan 荧光定量PCR检测方法(Taqman FQ-PCR);对所建立的FQ-PCR检测方法进行了敏感性、特异性和重复性实验,并对疑似猪链球菌临床样品进行了应用检测,同时与常规PCR方法进行了对比实验.结果显示:标准曲线的曲线循环闽值与模板浓度有良好的线性关系,相关系数为0.996;所建立的FQ-PCR方法检测灵敏度可迭1拷贝/μL,比对照常规PCR灵敏度高100倍;FQ-PCR方法特异性高,对pGEX-T-cps9H重组质粒和标准SS9株扩增曲线均呈现阳性反应,而对6个对照细菌和寄生虫DNA及SS2,SS7、SS1等三个标准链球菌株DNA扩增曲线均呈现阴性反应;对不同浓度的pGEX-T-cps9H重组质粒分别重复扩增4次,重复性良好;用该方法对11份临床疑似猪链球菌感染猪组织病料进行了应用检测,结果有3份样品为阳性,与常规PCR检测方法的阳性符合率为100％.
其他文献
本试验通过给断奶仔猪注射脂多糖(LPS)以模拟急性炎症反应条件,研究共轭亚油酸(CLA)的抗炎症作用.选用24头断奶仔猪(体重约8.0kg),采用2×2因子试验设计,即日粮(2％CLA或2％大豆油)和免疫刺激(注射LPS或生理盐水).在试验的第14和21d,给仔猪腹膜注射LPS或生理盐水后3h,前腔静脉采血.于第29d,给仔猪注射LPS或生理盐水后3h,屠宰仔猪取脾脏和胸腺.结果表明,日粮CLA抑
本研究采用抑制消减杂交技术(Suppressionsubtractivehybridization,SSH),分别构建了猪蛔虫雌、雄成虫性别特异消减cDNA文库,并采用地高辛(DIG)标记的cDNA探针进行SouthernBlot.检验所构建文库的特异性.从雌、雄虫文库分别挑取1044和1119个克隆,PCR扩增其插入片断,经纯化后点样于预先处理好的基片上,制备成cDNA微阵列芯片.将分别标记上荧
本文采用体重(18±1.68)kg的20头健康的松辽黑仔猪,分为5组,每组4头,分别为对照组,试验1、2、3、4组,用于研究7～10周龄时仔猪的免疫机能.于7～10周龄时,自仔猪前腔静脉采血,用显微镜法计数红细胞、淋巴细胞总数;噻唑蓝(MTT)比色法检测外周血中淋巴细胞转化率,E-玫瑰花环法检测花环形成率.结果表明,各试验组与对照组相比,7～10周龄时随着周龄的延长,酵母铁对仔猪免疫机能有提高的趋
本研究从12个规模化猪场分离64株大肠杆菌和36猪沙门氏菌,用β-内酰胺类药物(氨苄青霉素.头孢噻吩、头孢西丁、头孢他啶.孢曲松、头孢噻肟、亚胺培南、氨曲南、头孢噻夫、头孢吡肟,头孢泊肟)进行药敏实验,并对采集的菌株采用本实验室建立的多重PCR检测方法,进行β-内酰胺类药物耐药基因CTX-M、SHV和TEM的PCR检测,结果大肠杆菌及沙门氏菌对β-内酰胺类耐药率为氨苄青霉素86％、头孢噻吩29％、
构建猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)apxIA基因的真核表达载体pPICZαA/apxI,并在毕赤酵母GS115中进行表达.SDS-PAGE显示仅在浓缩40倍的上清中检测得到表达产物,同时经RT-PCR可检测到重组酵母中编码目的基因成熟肽的mRNA,经分析发现目的序列AT含量高达62％,其中含49个毕赤酵母稀有密码子,占15.4％.证实ApxIA在毕赤酵母中为低水平表达.
用PCR方法从胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清1型参考株259的基因组DNA中,扩增约954bp的apxIA基因片段,分别构建大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1/apxIA和毕赤酵母表达栽体pPICzαA/apxIA.对目的基因密码子偏好性进行分析,发现其中有4个大肠杆菌稀有密码子,占1.2％:有49个毕赤酵母稀有密码子,占15.4％.利用所构建的大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1/apxIA和毕赤
apxIV是胸膜肺炎放线杆菌的一种RTX毒素,为探究其在胸膜肺炎杆菌致病过程中的作用,以血清7型APPHB04为亲本菌株,通过接合转移和负向筛选方法,构建了一株apxIV基因缺失突变株.通过PCR、序列分析、Southernblot分析及遗传稳定性分析等实验证明,突变株构建是成功的.对突变株生物学特性进行初步研究,发现突变株与亲本菌株相比,体外生长速度未发生明显变化,对小鼠的致病力有所降低.结果表
通过接合转移和SacB负向筛选的方法,我们以本地分离的血清1型胸膜肺炎放线杆菌SLW01为素本菌,缺失毒素ApxI和ApxII的激活因子apxIC和apxIIC,构建不含标记的胸膜肺炎放线杆菌双基因缺失株SLW03(△apxIC/AapxIIC).研究表明,双缺失突变株失去溶血活性,但能分泌具有免疫原性的ApxIA和ApxIIA.突变株的生长能力未受影响,对Balb/C小鼠的毒力显著降低.以SLW
猪链球菌二型是一种新发现的人兽共患传染病,给国外的养猪业带来巨大的损失,并引起了高度关注,本文较为完整的综述了国内外学者对该菌的研究成果,其中主要包括毒力因子的发现,猪链球二菌的防治等.
以胸膜肺交放线杆菌(APP)apxIVA和猪圆环病毒II型(PCV2)ORF2为靶基因,根据其核苷酸序列分别设计高度特异性的引物和标记不同荧光报告基团的TaqMan探针,扩增片段大小分别为132bp和169bp,将其克隆到pMD-18T载体中,作为阳性标准品.经荧光PCR扩增获得两务标准曲线,建立了检测APP和PCV2的双重荧光PCR方法.该法可在同一反应体系中同时对APP和PCV2进行定量检测,